近日，中山大学中山医学院王金凯教授课题组在Molecular Cell（IF 14.5）上发表了题为“Single-molecule m⁶A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms”的研究成果。研究团队开发了一种名为m6Aiso的深度学习模型，在牛津纳米孔直接RNA测序的单个读长上检测m⁶A修饰。训练该深度学习模型是基于内源性标记产生的上百万个单分子m⁶A阳性电信号。该研究揭示了：1、不同m⁶A位点在单分子上存在距离依赖的连锁；2、相同的m⁶A位点在不同的异构体上也能够通过三种不同的机制产生广泛的差异；3、转录因子SMAD3在上皮-间充质转化过程中调控m⁶A选择性地上调使用的SMAD3结合的启动子的异构体的m⁶A，形成异构体特异的m⁶A调控。m6Aiso技术为研究m⁶A修饰的复杂性和动态变化提供了新的工具，为理解m⁶A在异构体上的复杂性提供了新的视角。

m⁶A是mRNA和多种非编码RNA上一种普遍且动态的修饰。而越来越多的研究表明m⁶A修饰与RNA异构体的生成和代谢密切相关。那么不同的RNA异构体上的相同m⁶A位点是否也能够产生差异的m⁶A修饰？尽管GLORI和eTAM-seq等技术能够以单核苷酸分辨率准确识别和定量m⁶A，但目前缺乏能够在单个完整RNA分子上准确识别m⁶A的方法，因此难以区分不同异构体上的m⁶A。而纳米孔直接RNA测序（ONT DRS）技术可以通过检测全长RNA通过纳米孔时的电流变化来检测m⁶A修饰，有望能解析RNA异构体的复杂性。由于纳米孔一次性读取多个碱基的电信号，缺乏高质量的单分子m⁶A修饰信号，训练能够准确识别单个DRS读取的模型仍是一个挑战。

研究者利用DART-seq技术，通过APOBEC1-YTH融合蛋白在活细胞中诱导m⁶A位点附近的C-to-U突变，以实现单核苷酸分辨率的m⁶A识别。研究发现，这些C-to-U突变并非集中于m⁶A邻近位置，而倾向于在距离m⁶A位点100 nt范围内聚集成簇。那么这些距离在10100nt范围内的突变能够用于标记m⁶A位点，而不会干扰ONT DRS中m⁶A甲基化5-mer的电流信号。基于这种内源性标记策略，研究团队利用在ONT DRS数据中提取了1,020,237个读长水平的5-mer m⁶A信号，并结合深度残差神经网络，成功开发了能够在单条读长水平上识别m⁶A的工具m6Aiso。此外，研究者还采用了kaiyun欧洲杯的SURFSeq 5000平台完成了A549细胞系的GLORI测序，为m6Aiso 在多个细胞系中的准确性评估提供了有力的支撑，同时也反映了SURFSeq 5000平台进行二代高通量测序具有高度的可靠性。如下图所示,研究团队在多个细胞系中比较了m6Aiso以及GLORI测序得到的m⁶A修饰水平，m6Aiso在HEK293T, HeLa, A549, mESC中都和GLORI高度一致，其中HEK293T, HeLa和 mESC的GLORI数据来源于原始的GLORI论文，而A549细胞的GLORI数据为团队自行建库后采用SURFSeq 5000平台完成的测序。

图1 不同细胞系m6Aiso和GLORI测序得到的m⁶A修饰水平比较

利用工具m6Aiso，研究者阐述了相同m⁶A位点不同的异构体上形成差异化m⁶A修饰的三种机制：1、EJC（外显子连接复合体）对m⁶A抑制的差异，与之前的研究一致，发现EJC会抑制靠近外显子边界的m⁶A沉积，即在异构体中外显子边界200 bp范围内的m⁶A甲基化水平较低；2、RNA结合蛋白对不同异构体RNA的特异性结合，如TARBP2结合内含子的邻近外显子上的m⁶A位点的甲基化水平显著高于未结合TARBP2内含子的邻近外显子；3、转录因子也会调控m⁶A，主要通过共转录的方式招募m⁶A 的甲基化转移酶来修饰其转录的RNA，因此使用不同启动子的RNA由于转录因子不同而产生差异的m⁶A修饰。由于变化的m⁶A位点位于共同的3'UTR，而短读长测序无法确定每个亚型的具体5'区域，因此这一发现进一步强调了在研究m⁶A动态变化时使用长读长测序的必要性。

图2 m⁶A在单reads上的内源性标记和m6Aiso在单分子水平上的结果评价

Guo WB Ren ZJ, Huang X, et al.Single-molecule m⁶A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms[J].Molecular Cell, 2025, 85: 1-14.