近日，国家纳米科学中心曹宇虹研究员团队在Advanced Science(IF 14.3)上发表了题为“Mitigating Cellular Dysfunction Through Contaminant Reduction in Synthetic circRNA for High-Efficiency mRNA-Based Cell Reprogramming”的研究成果。合成环状RNA(circRNA)在生物医学研究和治疗应用中具有巨大前景，但在合成过程中引入的杂质会激活固有免疫反应，显著影响其功效。研究团队对circRNA合成过程中RNA副产物的免疫原性进行了全面分析，鉴定了影响circRNA功能的关键杂质，并为减轻circRNA的免疫原性，开发了一种结合纤维素过滤和酶处理的逐步纯化策略。这种新的纯化方法不仅可以减轻免疫应答，还可以增强circRNA的表达，显著提高生产效率。该纯化策略为生产治疗级别的RNA提供了可靠方法，对再生医学和癌症免疫疗法具有重要意义。该研究采用SURFSeq 5000平台完成RNA测序工作。
CircRNA具有独特的结构特性，相比线性mRNA更稳定，抗降解，适合应用于癌症免疫疗法和疫苗开发等领域。在circRNA的合成过程中，会生成各种免疫原性副产物，这些副产物可以通过RNA感应途径触发免疫反应，影响circRNA的功能。当前的纯化方法，如RNase R酶消化和尺寸排阻液相色谱(SEC)，在去除结构化或线性副产物方面效果不佳，导致免疫激活和蛋白质表达减少。因此，亟需一种优化的纯化策略，以高效去除激活免疫反应的副产物。
通过尺寸排阻色谱(SEC)分离未纯化的编码绿色荧光蛋白的环状RNA (circ-eGFP)，得到3种不同组分：高分子量副产物组分(HMW)、主组分(circRNA、nicked RNA、线性RNA前体)和内含子片段组分。研究将不同分离组分或未纯化的circRNA转染到PMA分化的THP-1细胞中，然后进行转录组分析(SURFSeq 5000平台)、RT-qPCR验证及细胞因子检测，结果发现：不同组分都能改变基因表达，特别是HMW组分诱导了强烈的免疫反应，未纯化的circRNA及其组分显著富集了与免疫反应相关的通路，激活了多种RNA传感器，如TLR3/7/8、PKR、OAS、MDA5和RIG-I，导致细胞因子(如IFNβ、TNFα和IL6)和干扰素的产生。基于RT-qPCR分析，发现未纯化的circ-eGFP和HMW组分诱导了最高水平的RNA传感器和细胞因子表达，结果表明其具有较高的免疫原性。这些发现揭示了合成circRNA过程中产生的副产物对先天免疫系统的显著激活作用，有效的纯化策略就十分必要。
图1 由I型内含子自剪接法合成的环状RNA副产物激活先天免疫
研究人员鉴定了几种关键的免疫原性副产物，包括位于HMW中的dsRNA、5'三磷酸内含子、主组分中的nicked RNA和线性RNA前体。联合微晶纤维素(MCC)纯化、RNase R酶和磷酸酶法逐步纯化的circ-eGFP，免疫原性与SEC和酶处理常规法得到的超纯circ-eGFP相当，都可以有效纯化由I型内含子自剪接法合成的circRNA，有效减轻免疫反应。此外，木材衍生的多孔纤维素(WMC)也能高效去除不同长度的dsRNA，同时保持高回收率，适用于实验室和工业规模的生产，且纯化后circRNA在HeLa细胞和PBMCs中表现出高水平的蛋白表达，表明其在保持高纯度的同时，也保持了良好的功能性和低免疫原性。转录组分析表明，纯化后和未纯化的circRNA在转染细胞的基因表达与未处理对照组差异极小，进一步证实了其低免疫原性。
联合纯化策略获得的环状RNA显示出高的iPSCs的重编程效率
在细胞重编程过程中，即使是微量的杂质也可能显著影响蛋白表达和细胞功能，因此生产高纯度的circRNA对于高效的细胞重编程至关重要。研究人员使用来自转录因子OSKMLN的circRNA进行细胞重编程实验，结果显示，circRNA重编程的诱导多能干细胞(iPSCs)展现出与人类胚胎干细胞相似的全局基因表达模式，特别是关键多能性标记物的表达，表明成功抑制了体细胞转录程序并获得了多能状态。此外，转录组分析表明，circRNA重编程的iPSCs与人类胚胎干细胞在基因表达谱上高度一致，进一步验证了其多能性。这一结果表明，高纯度的circRNA能够有效支持细胞重编程，为再生医学和细胞治疗提供了新的工具。
本研究通过系统分析和优化纯化策略，成功解决了合成circRNA中的免疫原性杂质问题，显著提高了circRNA的纯度和功能，为其在再生医学和癌症免疫疗法中的应用提供了新的可能性。开发的纯化策略不仅提高了circRNA的生产效率和纯度，还为其在mRNA基础细胞编程中的应用提供了可靠的方法，特别是在iPSCs重编程和T细胞工程中表现出色。未来的研究应集中于进一步优化纯化过程，提高circRNA的环化效率，减少副产品，以实现大规模生产和临床应用的目标。
Zhang Z, Li W, Ren X, et al. Mitigating Cellular Dysfunction Through Contaminant Reduction in Synthetic circRNA for High‐Efficiency mRNA‐Based Cell Reprogramming[J]. Advanced Science, 2025: 2416629.